Gramkleuring is 'n vinnige tegniek en word gebruik om die teenwoordigheid van bakterieë in 'n weefselmonster te sien en om die bakterieë as Gram-positief of Gram-negatief te klassifiseer, gebaseer op die chemiese en fisiese eienskappe van hul selwande. Gramvlek word byna altyd gebruik as die eerste stap in die diagnose van 'n bakteriese infeksie.
Hierdie kleuringstegniek is vernoem na die Deense wetenskaplike Hans Christian Gram (1853 - 1938), wat die tegniek in 1882 ontwikkel het en dit in 1884 gepubliseer het as 'n tegniek om te onderskei tussen twee tipes bakterieë met soortgelyke kliniese simptome: Streptococcus pneumoniae (ook bekend as Streptococcus pneumoniae). Pneumococci) en die bakterie Klebsiella pneumoniae.
Stap
Metode 1 van 3: Voorbereiding van die mikroskoopskyfie
Stap 1. Maak gereed om in die laboratorium te werk
Dra handskoene en 'n lang haarstrop om bakteriële besmetting van die monster wat u toets, te voorkom. Maak die werkruimte skoon onder 'n afzuigkap, of in 'n ander goed geventileerde area. Kontroleer die Bunsen -brander en maak seker dat die mikroskoop behoorlik werk voordat u begin.
Stap 2. Steriliseer die mikroskoopglasskyfie
As die glasplaat vuil is, was dit met seepwater om olie en vuil te verwyder. Maak die skyfies skoon met etanol, glasskoonmaker of 'n ander metode wat deur u laboratorium gebruik word.
Stap 3. Plaas die monster op die glasplaat
U kan die Gram -vlektegniek gebruik om bakterieë in 'n mediese monster te identifiseer, of 'n kultuur van bakterieë wat in 'n petriskottel groei. Vir die beste resultate, gebruik Gram -vlek op dun strepe van die monster. Dit is raadsaam om monsters wat minder as 24 uur oud is, te gebruik, aangesien ouer bakterieë hul selwande beskadig het en moontlik nie reageer op Gram -kleuring nie.
- As u 'n weefselmonster gebruik, voeg 1-2 druppels by 'n glasplaat. Versprei eweredig op die skyfie om 'n dun laag monster besprenkeling te vorm deur dit met die rand van die ander steriele glasplaat te skuif. Laat dit droog word voordat u die volgende stap doen.
- As u bakterieë uit 'n petriskottel haal, steriliseer die inentingslus in 'n Bunsen -brander totdat dit brand, laat dit dan afkoel. Gebruik die lus om steriele water op die skyfie te drup, steriliseer dan en laat weer afkoel voordat u dit gebruik om 'n klein monster bakterieë te versamel. Roer daarna saggies.
- Die bakterieë wat in die sous berei word, moet weer met 'n draaikolk geroer word, en dan met die inentingslus soos hierbo geneem word, sonder om water by te voeg.
- As u 'n dekselmonster het (gewoonlik met 'n klein handvatsel), raak die depper saggies en draai dit oor die skyfie.
Stap 4. 'n Effens hoë temperatuur kan 'n goeie smeer gee
Die hitte hou die bakterieë bo -op die skyfie vas, sodat hulle nie maklik oplos tydens die vlekproses nie. Tik die skyfie vinnig twee tot drie keer oor 'n Bunsen -brander, of verhit die skyfie oor 'n elektriese glyverwarmer. Moenie oorverhit nie, die monster kan beskadig word. As u 'n Bunsen -brander gebruik, moet dit 'n klein maar blou vlam wees in plaas van 'n groot oranje vlam.
Alternatiewelik kan 'n besmetting ook met metanol gemaak word deur 1-2 druppels metanol by 'n droë smeer te voeg en die oorblywende metanol op die skyfie te droog deur dit in die buitelug te laat. Hierdie tegniek verminder selskade en bied 'n skoon skyfie -agtergrond
Stap 5. Plaas die skyfie oor die kleurplaat
Vlekbakke is gemaak van metaal-, glas- of vlak plastiekborde met 'n sagte gaas aan die bokant. Plaas die skyfies bo -op hierdie nette sodat die vloeistof wat u gebruik in die skinkbord kan dreineer.
As u nie 'n kleurplaat het nie, kan u 'n skyfie op 'n plastiekbak plaas om ysblokkies te druk
Metode 2 van 3: Gramvlekproses
Stap 1. Giet die kristalviolet vloeistof oor die smeer
Gebruik 'n pipet om 'n monster bakterieë met 'n paar druppels kristalviolet kleurstof, ook bekend as gentiaan violet, te spuit. Laat dit vir 30-60 sekondes. Kristalviolet (KV) skei in waterige oplossing in KV+ en chloried (Cl-) ione. Hierdie ione dring deur die selwande en selmembrane van beide gram-positiewe en gram-negatiewe bakterieë. Die KV+ -ioon werk in wisselwerking met die negatief gelaaide komponente van die bakteriese selle, wat die selle 'n pers kleur gee.
Baie laboratoriums gebruik kristalviolet "Hucker", wat ammoniumoksalaat bevat om neerslag te voorkom
Stap 2. Spoel die kristalviolet saggies af
Kantel die skyfie en gebruik 'n spoelbottel om 'n klein stroom gedistilleerde of kraanwater oor die skyfie te spuit. Water moet oor die oppervlak van die smeer vloei en moet nie direk op die smeer gespuit word nie. Moenie oormatig spoel nie. Dit kan vlekke in gram -positiewe bakterieë verwyder.
Stap 3. Spoel die smeer met jodium af en spoel dit dan af
Gebruik 'n drupper om die besmetting met jodium te spoel. Laat dit vir minstens 60 sekondes aan, spoel dan versigtig op dieselfde manier as hierbo. Jodium, in die vorm van 'n negatief gelaaide ioon, werk in wisselwerking met KV+ om 'n groot saamgestelde kompleks te vorm tussen kristalviolet en jodium (CV-I-kompleks) in die binne- en buitenste lae van die sel. Hierdie kompleks van verbindings behou die violet kleur van die kristalviolet binne -in die sel, op die bevlekte plekke.
Jodium is 'n bytende stof. Vermy inaseming, inname of kontak met die vel
Stap 4. Voeg kleurbleikmiddel by en spoel dit dan vinnig af
'N 1: 1 -mengsel van asetoon en etanol word gewoonlik gebruik vir hierdie belangrike stap, wat noukeurig bepaal moet word. Plaas die skyfie in 'n sekere hoek en voeg dan kleurbleikmiddel by totdat daar nie meer pers is in die water wat gebruik word om te spoel nie. Dit neem gewoonlik minder as 10 sekondes, of selfs minder tyd as die bleikmiddel 'n hoë asetoonkonsentrasie bevat. Stop hierdie stap onmiddellik, anders lek die kleurstof ook kristalviolet uit die gram-positiewe en negatiewe selle, en die kleuring moet herhaal word. Spoel die oortollige kleurbleikmiddel onmiddellik af met die vorige tegniek.
- Suiwer asetoon (95%+) kan as plaasvervanger gebruik word. Hoe meer asetoon u gebruik, hoe vinniger werk die bleikmiddel, sodat u meer aandag moet skenk aan die tydsberekening.
- As u probleme ondervind om die tyd vir hierdie stap by te hou, voeg kleurbleikmiddel druppel vir druppel by.
Stap 5. Sprinkel die teenverf oor die smeer en spoel dit dan af
'N Teenvlek, gewoonlik safranien of fuchsien, word gebruik om die kontras tussen gram-negatiewe en gram-positiewe bakterieë te verhoog deur ontkleurde (ontkleurde) bakterieë, dit wil sê gram-negatiewe bakterieë, pienk of rooi te laat vlek. Laat ten minste 45 sekondes staan, spoel dan af.
Fuchsin sal baie gram-negatiewe bakterieë, soos Haemophilus spp en Legionella spp, intensief vlek. Hierdie metode is goed vir beginners
Stap 6. Droog die skyfie
U kan dit in die buitelug droogmaak om dit te droog, of dit droog te maak met papier wat vir hierdie doel verkoop word. Die Gram -kleuring is voltooi.
Metode 3 van 3: Kontroleer die kleurresultate
Stap 1. Berei die ligmikroskoop voor
Plaas die skyfie onder die mikroskoop. Bakterieë wissel baie in grootte, dus die totale vergroting wat benodig word, wissel van 400x tot 1000x. 'N Objektiewe lens met dompelolie word aanbeveel vir 'n skerper beeld. Gooi die dompelolie op die skyfie, vermy beweging terwyl dit drup om te voorkom dat daar borrels vorm. Beweeg die handvatsel van die mikroskoop sodat die objektief op sy plek klik en die olie raak.
Onderdompeling in olie kan slegs op spesiaal ontwerpte lense gebruik word, nie op "droë" lense nie
Stap 2. Probeer om gram -positiewe en gram -negatiewe bakterieë te identifiseer
Kyk na die skyfie onder 'n ligmikroskoop. Gram-positiewe bakterieë lyk pers van kleur, omdat die kristalviolet binne die dik selwand vasgevang is. Gram-negatiewe bakterieë sal pienk of rooi van kleur wees, omdat die kristalviolet deur die dun selwande uitgespoel word, waar die pienk teenverf ingaan.
- As die monster te dik is, kan die resultaat vals positief wees. Vlek 'n nuwe monster as dit alle gram -positiewe bakterieë toon, om seker te maak dat die resultaat korrek is.
- As u te veel kleurbleikmiddel gebruik, kan die resultaat vals negatief wees. Vlek 'n nuwe monster as dit alle gram -negatiewe bakterieë toon, om seker te maak dat die resultaat korrek is.
Stap 3. Vergelyk die resultate wat u sien met die verwysingsbeeld
As u nie weet hoe bakterieë lyk nie, bestudeer die versameling verwysingsbeelde, gewoonlik gesorteer volgens vorm en gramvlek. U kan ook aanlyn databasisse bekyk by [National Microbial Pathogen Database, Bacteria in Photos en vele ander aanlynwebwerwe. Om identifikasie te vergemaklik, volg voorbeelde van bakterieë wat algemeen voorkom of belangrik is vir die diagnose, geklassifiseer volgens hul Gram -status en vorm.
Stap 4. Identifiseer gram-positiewe bakterieë op grond van hul vorm
Bakterieë word verder ingedeel volgens hul vorm onder die mikroskoop, meestal as kokkies (sferies) of stange (silindries). Hier is 'n paar voorbeelde van gram-positiewe bakterieë (pers van kleur) volgens hul vorm:
- Gram positiewe kokkies gewoonlik stafilokokke (wat groepskokke beteken) of streptokokke (wat kettingkokkies beteken).
- 'Gram -positiewe stokke soos Bacillus, Clostridium, Corynebacterium en Listeria. Die staafbakterie Actinomyces spp. het gewoonlik takke of filamente.
Stap 5. Identifiseer gram -negatiewe bakterieë
Gram-negatiewe bakterieë (pienk van kleur) word dikwels in drie groepe ingedeel. Kokkies is sferies van vorm, stokke is lank en dun, terwyl kokkoïedstawe tussenin is.
- Gram negatiewe kokkies Die algemeenste is Neisseria spp.
- Gram-negatiewe stawe E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas en vele ander. Vibrio cholerae kan gesien word as 'n gewone stam of 'n geboë stam.
- Gram-negatiewe "coccoid" (of "coccobacilli") staafbakterieë byvoorbeeld Bordetella, Brucella, Haemophilus en Pasteurella
Stap 6. Kyk noukeurig of die resultate gemeng is
Sommige bakterieë is moeilik om presies te kleur as gevolg van die broosheid of wasagtige aard van hul selwande. Hierdie bakterieë kan 'n mengsel van pers of pienk in dieselfde sel of tussen verskillende selle in dieselfde smeer vertoon. Bakteriële monsters ouer as 24 uur kan hierdie probleem toon, maar daar is ook 'n paar bakteriespesies wat op enige steekproeftydperk moeilik is om te kleur. Hierdie bakterieë benodig meer gespesialiseerde toetse vir identifikasie, soos suurvaste kleuring, waarneming in bakteriekultuur, TSI-kultuurmedia of genetiese toetse.
- Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium en Propionibacterium spp. almal is gram-positiewe bakterieë, maar word dikwels nie duidelik gekleur nie.
- Klein, skraal bakterieë soos Treponema, Chlamydia en Rickettsia spp. moeilik om te vlek deur die Gram -metode.
Stap 7. Gooi die oorblywende verbruiksgoedere en toerusting weg
Hierdie prosedure vir die verwydering van afval wissel tussen laboratoriums en hang af van die materiaal wat gebruik word. Gewoonlik word die vloeistof in die vlekbak weggegooi in bottels wat as gevaarlik afval gemerk is. Week skyfies in 10% bleikoplossing en gooi dit dan in 'n skerp houer.
Wenke
- Onthou dat die resultate van Gram -vlek slegs goed sal wees as die monster goed is. Dit is belangrik om pasiënte in kennis te stel sodat hulle 'n goeie voorbeeld kan gee (bv. Die verskil tussen spuug versus diep hoes om 'n sputummonster te verkry).
- As kleurbleikmiddel reageer etanol stadiger as asetoon.
- Volg die standaard laboratoriumregulasies om veiligheid te verseker.
- Gebruik 'n wangstok om te oefen, want dit bevat beide gram-positiewe en gram-negatiewe bakterieë. As u slegs een tipe bakterie sien, gebruik u moontlik te min of te veel bleikmiddel.
- U kan houtsnitte gebruik om die skyfie vas te maak.
Waarskuwing
- Asetoon en etanol is vlambare stowwe. Asetoon verwyder die olie uit u hande, wat dit makliker maak vir u vel om ander chemikalieë op te neem. Dra handskoene en gebruik dit versigtig.
- Moenie die besmetting laat droog word voordat u die Gram -vlek of teenvlek afspoel nie.
Wat jy nodig het
- Netwerkvoorbeeld
- Glasskyfie
- Pipet
- Klein vuurbron, of skyfverwarmer, of metanol
- Water
- Kristalviolet
- Jodium
- Kleur bleikmiddel, soos alkohol of asetoon
- Safranin
